Специфические лабораторные методы применяются для диагностики гепатита С. К ним относятся иммунохимические, молекулярно-биологические анализы распознавания РНК-содержащего вируса (ВГС).
[info-box type=»bold»]Интерпретация полученных данных зависит от:[/info-box]
- [info-box type=»italic»]Чувствительности[/info-box] применяемого метода. Это способ определения минимального компонента в величине разведения — антител, антигенов, нуклеиновых кислот. Выражается в количественных единицах — титрах.
- [info-box type=»italic»]Специфичности[/info-box] конкретного метода, способного выявить ВГС и антитела к нему
Цель работника лаборатории заключается в разграничении ложноположительных анализов на гепатит С и обнаружение вируса и антител к нему.
Анализы на гепатит С
Постановка диагноза HСV-инфекции происходит с помощью вирусологических (ПЦР) и серологических тестов (ИФА).Симптоматика острой фазы заболевания практически отсутствует, но уже в первые 7-14 дней после инфицирования диагностировать этот период гепатита С можно при обнаружении РНК методом ПЦР.
Применение ИФА в этой стадии не результативно, так как антитела вырабатываются через несколько недель. Изобретение тестовых систем 3 поколения способствует определению IgM в ранние сроки. Метод используют в лабораториях, но он не отвечает целям полной диагностики и оценки эффективности лечения.
ИФА
Метод иммуноферментного анализа разработан в трех вариантах: иммуноферментный, радиоиммунный, флюороиммунный. Востребован твердофазный ИФА. В постановке реакции он прост, высокочувствителен и относительно не дорог.
В зависимости от агента, который определяют — антиген или антитело, ИФА представляет разную ценность в диагностике. Верные результаты получаются при выявлении вирусных антигенов. Это также не является критерием постановки диагноза, так как часть антигенов расположена только в печеночной ткани и в крови обнаружить их не возможно. Поэтому нужно применять ИФА с определением сразу двух видов вирусных антигенов.
При обнаружении антител к ВГС нельзя говорить о присутствии вируса. Выявлены случаи когда анализ ИФА оказывается ложноположительным у обследуемого. Это указывает на иммунологическую память ранее присутствующего вируса в организме.
В проведенных исследованиях 957 проб с положительным ИФА потребовались другие арбитражные методы — ПЦР. В итоге у 36,6% РНК не обнаружилось, что свидетельствует о получении ложноположительного ответа.
Разработанные за последнее десятилетие новые тестовые системы способны одновременно определять антитела и антигены к вирусу гепатита С.
ПЦР
Этот метод детекции — полимеразная цепная реакция, создан для обнаружения вирусной РНК в образце сыворотки крови. Исследование заключается в многоцикловом процессе, который состоит из переходящих друг в друга этапов.
С помощью применения обратной транскриптазы (фермента) образуются молекулы ДНК вируса гепатита С. Итоговый результат — выделение вирусной рибонуклеиновой кислоты. Количественный вариант ПЦР используют для определения концентрации РНК. Исследуется количество копий в 1 мл. Выражается в логарифмических выражениях (log10).
Для прогнозирования эффективности лечения важным является выяснение принадлежности гепатита С к генотипу. В проведении генотипирования используют типоспецифические праймеры, в методах основанных на методике ПЦР.
Чувствительным методом определения нуклеиновых кислот считается «ПЦР в реальном времени». С помощью этого метода получают результат в ходе реакции даже при малом количестве нуклеиновых кислот. Полученные показатели с высокой точностью определяют уровень вирусной нагрузки.
Может ли анализ на гепатит С быть ошибочным?
На сегодня по-прежнему остается шанс получения ложноположительного результата на наличие анти-ВГС. При определенных обстоятельствах искаженные данные получаются при проведении ИФА и ПЦР.
[info-box type=»bold»]Доля ошибочных ложноположительных результатов составляет 10-20%.[/info-box]
Для уточнения нахождения вируса в крови обследуемого человека применяют метод обнаружения РНК совместно с другими чувствительными методами. Однако получение отрицательного ответа не свидетельствует о ложноположительном ответе. В случаях полного выздоровления пациентов (10-15%) в крови возможно присутствие анти-ВГС.
[info-box type=»bold»]Получение ложноположительного результата зависит от естественных причин:[/info-box]
- появление мутантных штаммов;
- репродукции антител и антигенов возбудителя.
Причины ложноположительного анализа
Ошибочный анализ регистрируется в виде ложнонегативных и ложнопозитивных результатов.
[info-box type=»bold»]Ложноположительный ответ получается при:[/info-box]
- смешении исследуемого образца с предыдущим через лабораторное оборудование или аэрозоли;
- соединение между пробами при работе с реакционной смесью.
[info-box type=»bold»]Ложноотрицательные ответы определения РНК получаются при:[/info-box]
- нарушениях правил перевозки клинических образцов;
- несоблюдении теплового режима образцов крови;
- распад РНК при подготовке к пробе;
- поэтапное прохождение ПЦР нарушает гепарин и высокий уровень криоглобулинов;
- присутствие в сыворотке белковых, химических субстанций.
[info-box type=»bold»]Распространенные причины ошибок анализов связаны с:[/info-box]
- иммунодефицитными состояниями;
- онкологией;
- аутоиммунными заболеваниями (синдром Рейно, полинейропатия, узелковый периартериит и другие);
- поражениями системы крови (тромбоцитопения, гемолитическая анемия);
- глистными инвазиями;
- сифилисом.
Человеческий фактор
Ошибка в анализе возможна с учетом действия работников, участвующих в процессе, с процедурного кабинета и до клинической лаборатории.
[info-box type=»bold»]Человеческий фактор возможен при:[/info-box]
- нарушении нумерации пробирок в момент забора крови;
- указании ошибочного ответа;
- неправильных действиях лаборанта в ходе подготовки образца;
- проведении пробы в условиях повышенной комнатной температуры;
- неопытности молодого специалиста;
- изготовлении некачественных диагностических препаратов.
Моментом, который способен искажать данные исследований является алкоголь. Это своеобразный антидепрессант, который воздействует на диагностику гепатита С. У пьющих людей с хронической формой выявляться HCV РНК при отсутствии антител и наоборот.
Ложноположительный результат у беременных
Установленный гепатит С ложноположительный у беременной женщины может быть связан с физиологическими изменениями происходящими в организме в период вынашивания плода:
- выработку характерных гестационному периоду белков;
- полную перестройку гормональной системы;
- повышение концентрации противовоспалительных цитокининов;
- изменение биохимических показателей;
- присоединение инфекций бактериального и вирусного генеза.
Инфекционные заболевания
Инфекционные заболевания протекают с выделением антител (защитные факторы крови) в ответ на антигены (болезнетворные возбудители). Работа иммунитета человека заключается в выработке иммуноглобулинов в ответ на проникновение чужеродных агентов.
Одновременное выделение иммуноглобулинов при инфекционном процессе в сочетании с гепатитом С искажает результаты анализов ИФА, что ведет к возрастанию количества ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
[info-box type=»bold»]Инфекции, которые приводят к ошибке:[/info-box]
- токсоплазмоз;
- цитомегаловирус;
- передающиеся половым путем (уреаплазма, микоплазма, трихомоноз).
Лабораторная диагностика гепатита С при коинфекции с ВИЧ затруднена. Ложноотрицательный ИФА по выявлению анти-ВГС связан с формированием иммунодефицита у человека. Поэтому всегда проводится исследование РНК методом ПЦР.
Как избежать ложноположительного результата?
[info-box type=»bold»]Ошибочный диагноз гепатита сводят к минимуму благодаря:[/info-box]
- качественному обучению лабораторных работников и прохождению курсов повышения квалификации;
- проведению этапов ПЦР в изолированных зонах;
- применению автоматических пипеток для каждого этапа реакции;
- проведение дополнительных анализов для уточнения.
Исключить ложноположительный результат возможно при проведении дополнительных (supplemental) тестов. Это препараты, созданные специально для определения антител к конкретным белкам, кодированных разными зонами вирусной РНК.
Внедрение новых методик лабораторного исследования вирусного гепатита С обеспечивает раннюю диагностику заболевания и сводит к минимуму появление ложных результатов. Это мера способствует своевременно начатому лечению, которое заканчивается выздоровлением.
